Le projet scientifique

Le projet scientifique thématique 1

Biologie vasculaire et du globule rouge (BVGR)

1-Introduction 

Les hémoglobinopathies, et particulièrement la drépanocytose, maladie génétique la plus répandue dans le monde, constituent une thématique forte de notre laboratoire. La drépanocytose est caractérisée par la présence d’une hémoglobine mutée (HbS) qui polymérise lorsqu’elle est désoxygénée. Ce processus est responsable de la falciformation des globules rouges qui deviennent rigides et fragiles. Les patients présentent une anémie chronique associée à des crises vaso-occlusives (CVO) douloureuses et imprévisibles. Deux phénotypes biologiques/cliniques complémentaires ont été décrits :

1) un phénotype visqueux-vaso-occlusif, dans lequel des anomalies de l’adhérence vasculaire et une viscosité sanguine trop élevée augmenteraient le risque de survenue de CVO (Connes et al, 2014).

2) un phénotype hémolytique, dans lequel ces patients seraient prédisposés à développer une vasculopathie et une dysfonction vasculaire importante de par les effets toxiques de l’hémoglobine libre sur l’endothélium et le métabolisme du monoxyde d’azote. Ce deuxième phénotype serait responsable de complications telles que les accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques et l’hypertension artérielle pulmonaire (Kato et al, 2007). Nos travaux montrent que les anomalies de la rhéologie du globule rouge ainsi que l’inflammation et le stress oxydatif sont des acteurs majeurs du développement de ces vasculopathies dans la drépanocytose (Connes et al, 2013 ; Bourgeaux et al, 2012 ; Connes et al, 2016). Bien que les mécanismes conduisant au développement d’une vasculopathie (systémique, pulmonaire ou cérébrale) dans la drépanocytose ne soient pas complètement identiques à ceux observés dans les autres maladies cardiovasculaires et en particulier dans l’athérosclérose, ils partagent un certain nombre de points physiopathologiques communs (rôle du monoxyde d’azote, du stress oxydant, de l’inflammation et de l’adhérence vasculaire). Par conséquent, nos projets s’articuleront autour de la drépanocytose, mais aussi de l’athérosclérose, thématique émergente dans notre équipe.

 

2- Approches fondamentales et cliniques :

Notre projet propose des approches fondamentales (moléculaires, cellulaires et animales) et cliniques (études de cohortes, approches biologiques, histologiques et épidémiologiques). La comparaison des mécanismes physiopathologiques dans ces différentes populations devrait permettre de mieux comprendre les causes des dysfonctions vasculaires. Par ailleurs, des approches thérapeutiques seront envisagées sur des modèles murins afin de prévenir le développement et/ou la progression d’une vasculopathie. L’équipe « Biologie Vasculaire et du Globule Rouge » du LIBM est partenaire associé du LABEX Gr-EX (Paris, Dir : Pr O. Hermine), dont la recherche biomédicale/clinique sur la drépanocytose est une priorité ainsi que du Groupement de Recherche (GDR, CNRS) MECABIO dont les aspects rhéologiques et écoulement du sang sont une des priorités. Enfin, l’équipe « Biologie Vasculaire et du Globule Rouge » collabore étroitement avec le LABEX LUMNEV (Université de Montpellier) autour de la caractérisation hémorhéologique en condition de flux du sang drépanocytaire.

 

2-1 Fonction vasculaire et hémoglobinopathies :

2-1-1 Hémolyse et anomalies hémorhéologiques dans les vasculopathies drépanocytaires : approches épidémiologiques, cliniques et thérapeutiques

La drépanocytose est également considérée comme une maladie de la paroi vasculaire (Kato et al, 2007). Cette dysfonction serait causée par l’hémolyse chronique (Kato et al, 2007). Si c’est le cas, une dysfonction vasculaire plus marquée devrait se retrouver chez les patients drépanocytaires à risque, avec des complications hémolytiques telles que la glomérulopathie, les ulcères de jambes et le priapisme. Cette hypothèse sera testée sur 240 drépanocytaires homozygotes SS et 120 drépanocytaires SC au Mali (Bamako) et au Sénégal (Dakar) dans le projet BIOCADRE, sélectionné à l’ANR 2014 (IP : X. Jouven-UMR Inserm 970-Paris, UMR Inserm 1134-Paris/Guadeloupe). L’équipe BVGR du LIBM analysera des marqueurs hémorhéologiques et du stress oxydatif  étant donné le rôle clef des propriétés rhéologiques des globules rouges et du stress oxydatif dans les complications dîtes vasculopathiques (Connes et al, 2014). Cependant, les facteurs modulateurs de ces anomalies ne sont pas complètement élucidés. Des études d’association sur les cohortes pédiatriques et adultes drépanocytaires, seront réalisées à Lyon et en Guadeloupe. Elles visent à déterminer le rôle joué par le stress oxydatif et les facteurs génétiques (α-haplotype, déficience en G6PD, polymorphismes eNOS et α-thalassémie) dans les anomalies hémorhéologiques, le profil hémolytique et la survenue de complications vasculopathiques (projet en collaboration avec les Hôpitaux Civils de Lyon : Dr. K. Kebali, Dr N. Garnier, Dr. G. Cannas, Dr. A. Gauthier, Pr A. Hot, Dr S. Poutrel, Pr Y. Bertrand, Dr P. Joly ; l’UMR Inserm 1134 – Unité Transversale de la Drépanocytose en Guadeloupe : Dr M. Romana, Dr M.D. Hardy-Dessources, Dr N. Lemonne, Dr M. Etienne-Julan). Une partie de ce projet est financé par les crédits de l’Institut Universitaire de France de P. Connes. Par ailleurs, un projet récemment financé par le Labex GR-Ex portera sur la microcirculation cérébrale (technique ASL (Arterial Spin Labelling) et Spectroscopie dans le Proche Infra-Rouge)) et les déterminants hémorhéologiques des micro-infarctus cérébraux chez les drépanocytaires homozygotes. Il s’agit du projet DREAM2 piloté par le Dr V Brousse en collaboration avec les Dr S Verlhac, C Pondarré, L Da Costa, M De Montalembert et C Le Van Kim (Hôpital Necker, CHIC Créteil et UMR Inserm 1134). L’équipe BCVG du LIBM sera impliqué dans les traitements de signaux hémodynamiques et dans l’analyse des mesures hémorhéologiques. Une attention particulière, à visée d’amélioration thérapeutique, sera également dédiée à la vasculopathie cérébrale, notamment à travers l’étude des effets de l’érythraphérèse, connue pour modifier le profil hémato-hémorhéologique, sur le niveau d’oxygénation cérébrale des patients drépanocytaires caractérisés par un doppler transcrânien pathologique. Ce projet est piloté par Thomas Rupp, en collaboration avec le CHU de Créteil (Dr P. Bartolucci). Les modifications de la rhéologie du sang après érythraphérèse (manuelle vs automatique) seront analysés par les Dr P. Bartolucci et l’équipe BVGR du LIBM. Enfin, un projet en collaboration avec l’UMR CarMeN Inserm U1069 (Dr M. Wiart ; Pr E. Canet-Soulas ; Université Lyon 1) est en cours sur la caractérisation de la vasculopathie cérébrale et des AVC silencieux au cours de l’âge chez la souris drépanocytaire Townes.

Par ailleurs, nous avons mis en évidence que le muscle squelettique, au même titre que bien d’autres organes, subissait les conséquences de la maladie. En particulier, un profond remodelage microvasculaire était observé au sein du tissu musculaire, incluant une raréfaction des microvaisseaux une moindre tortuosité capillaire et un fort élargissement du lumen. Cependant, aucun renforcement de la paroi capillaire n’était apparent. Si ce remodelage pourrait limiter le risque d’obstruction de la microcirculation par les globules rouges rigides, il semble aboutir à une fragilisation des microvaisseaux. Ses causes ne sont pas identifiées mais le profil hémorhéologique spécifique ainsi que l’hémolyse chronique pourrait jouer un rôle. Une étude corrélationnelle sera ainsi conduite afin de déterminer les paramètres hématologiques et hémorhéologiques les plus impliqués dans le remodelage microvasculaire observé par notre équipe (Ravelojaona et al, 2015).

Enfin, nous avons récemment montré (Diaw et al, 2015) que les porteurs sains de la mutation génétique responsable de la drépanocytose (trait drépanocytaire) qui sont diabétiques de type II, étaient marqués par une dysfonction vasculaire plus importante que celle des diabétiques non porteurs du trait drépanocytaire (projet en collaboration avec le Sénégal, financée par l’Ambassade de France), Nous sommes entrain de caractériser les mécanismes de cette dysfonction vasculaire plus marquée en utilisant un modèle de souris porteuses du trait drépanocytaire (Townes AS) rendu diabétique de type 2 en collaboration avec l’équipe UMR CNRS 5305 (ICBP, Lyon, Dr. Bérangère Fromy). Une étude de cohorte au Sénégal sur les conséquences cardiovasculaires est également prévue pour fin 2016 (collaboration avec Dr M. Diaw).

 

2-1-2 Rôle du NO et du stress oxydatif dans les vasculopathies drépanocytaires

En parallèle de la recherche clinique, des études expérimentales à visée préclinique seront réalisées sur un modèle de souris transgénique de la drépanocytose (souris Townes). Nos travaux porteront sur le rôle du stress oxydatif et du monoxyde d’azote dans la vasculopathie drépanocytaire. Différents antioxydants (mimétiques des enzymes antioxydantes et voie de la NADPH oxydase) seront testés, en présence ou pas de précurseurs du NO (L-arginine), sur le phénotype vasculaire de la souris Townes. Une partie du travail porte également sur la voie Nfr2 en collaboration avec un laboratoire de Pittsburgh (mobilité internationale d’une doctorante du LBIM au Vascular Medecine Institute, University of Pittsburgh, Pr S. Ofori-Acquah). Enfin, le LBIM est porteur d’un projet, en collaboration avec une équipe Allemande (Dr M. Grau et Pr W. Bloch, Institute of Cardiovascular Research and Sport Medicine, Cologne) et l’UMR Inserm 1134 (Biologie Intégrative du Globule Rouge) visant à caractériser le rôle de la NO synthase érythrocytaire dans la régulation des propriétés hémorhéologiques, des mécanismes d’éryptose et de la fonction vasculaire dans un modèle murin de la drépanocytose et chez les patients (projet financé par la Fondation Allemande pour la Recherche).

 

2-2 Hémorhéologie, biophysique et hémoglobinopathies :

L’équipe BVGR du LIBM mène plusieurs projets en collaboration avec l’UMR 5048 CNRS (CBS, Montpellier, Dr M. Abkarian) et l’UMR 5149 (IMAG, Montpellier, Dr S. Mendez) sur le comportement rhéologique des globules rouges en condition dynamique, en utilisant des dispositifs de microfluidique à géométrie variable et l’hypoxie. Un projet dont l’équipe BVGR du LIBM est partenaire a récemment été déposé au sein du Labex LUMNEV et à l’appel d’offre ANR 2016.

 

2-3 Athérosclérose et vasculopathie cérébrale : Etude du rôle du stress oxydatif sur les facteurs de vulnérabilité cérébrale et d’instabilité de la plaque d’athérosclérose.

Bien que le pourcentage de sténose carotidienne soit encore le marqueur de risque de l’AVC ischémique conduisant à l’endartériectomie, l’instabilité de la plaque carotidienne est un facteur de risque reconnu. L’hémorragie, l’accumulation de macrophages intra-plaque, ainsi que la néo-vascularisation sont aussi des marqueurs de l’instabilité de plaque (Finn et al, 2012). Le stress oxydatif pourrait jouer un rôle majeur dans la régulation de ces trois facteurs. Notre modèle de souris athérosclérose (ApoE-/- âgées sous régime gras, thèse d’E. Chirico), a montré une co-localisation cérébrale de l’accumulation de macrophages et des fuites de la barrière hémato-encéphaliques ainsi qu’un stress oxydatif cérébral plus élevé que les souris contrôles.

D’abord, nous caractériserons l’implication du stress oxydatif dans la récupération cérébrale post-AVC chez les souris ApoE-/-. Le suivi longitudinal de la lésion post-AVC sera effectué par IRM après avoir soumis les souris à une ischémie cérébrale transitoire tandis que le stress oxydatif sera modulé avec des mimétiques des enzymes antioxydantes. L’ischémie cérébrale sera également utilisée sur notre modèle murin de la drépanocytose pour valider un modèle de vasculopathie cérébrale dans cette maladie. Ensuite, nous envisageons une étude clinique pour caractériser la néo-vascularisation, l’état hémorragique et la polarisation des macrophages de la plaque carotidienne chez des patients à risque d’AVC symptomatiques et asymptomatiques. Cette étude a un double objectif : 1) déterminer l’importance du stress oxydatif sur ces trois facteurs d’instabilité de la plaque en fonction du risque d’AVC, à partir d’échantillons de plaque obtenus après endartériectomie; 2) valider les données histologiques par IRM pour un meilleur diagnostic et suivi des patients à risques. L’hémolyse exacerbée joue un rôle important dans le développement de la vasculopathie cérébrale chez le drépanocytaire via une modification des propriétés biophysiques des globules rouges. L’hémolyse intra-plaque chez les patients à risque d’AVC (Takaya et al, 2006) pourrait donc accentuer ce risque en augmentant la vulnérabilité vasculaire cérébrale. Nous étudierons donc la déformabilité et la fragmentation érythrocytaire par ektacytométrie. Ces projets seront financés par l’Institut Universitaire de France de V. Pialoux (2014-2019), dont une partie entre dans le projet AV-TEPIRM présélectionné à l’ANR 2014 (IP: E. Canet-Soulas). Ce dernier vise à valider le suivi IRM de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et l’activation macrophagique chez l’animal. Deux laboratoires de l’Université de Lyon, leader internationaux dans leur domaine (CREATIS Inserm U1044, imagerie médicale et CarMeN Inserm U1069, Cardiologie et Métabolisme ; Pr E. Canet-Soulas, Dr M. Wiart) seront collaborateurs avec l’appui du centre d’imagerie ‘petit animal’ (CERMEP), notamment sur la technique d’ischémie cérébrale focale transitoire et sur le suivi IRM des animaux. Le projet clinique s’appuie sur le service de chirurgie vasculaire des Hospices Civiles de Lyon (Dr A. Millon).

 

3- Effets thérapeutiques de l’exercice physique (régulier contrôlé)

Alors que les effets cardio- et vasculo-protecteurs d’une activité physique régulière sont bien démontrés dans la population générale, peu d’études ont porté sur des patients à risque d’AVC et aucune sur les sujets drépanocytaires. Les effets anti-inflammatoires, antioxydants, hémorhéologiques, vasculaires et hématologiques bénéfiques d’une pratique physique régulière sont susceptibles de diminuer la sévérité clinique des patients atteints de ces maladies également.

 

3-1 Drépanocytose

Les changements métaboliques et les risques accrus de désaturation de l’HbS survenant à l’effort (Waltz et al, 2013) sont des déclencheurs potentiels de CVO. Cependant, des études récentes chez l’homme ou l’animal montrent que les drépanocytaires peuvent réaliser une activité physique modérée sans risque clinique (Balyssac-Syransy et al, 2011 ; Faes et al, 2014 ; Aufradet et al, 2014). Ainsi, nous testerons aussi les effets biologiques, vasculaires, microvasculaires (études fonctionnelles et caractérisation morphologique après biopsie), hémodynamiques et hémorhéologiques de protocole de conditionnement physique chez la souris et le patient drépanocytaire (cohortes Lyonnaises, collaboration avec les Hôpitaux Civils de Lyon, projet planifié à moyen terme). Les effets cliniques de l’exercice physique chronique chez le patient drépanocytaire seront également évalués à travers la quantification du nombre d’évènements vaso-occlusifs avant et après ré-entraînement, le suivi de la qualité de vie ainsi que l’évaluation des douleurs chroniques. La survenue d’un syndrome thoracique aigu sera un motif d’arrêt du ré-entraînement pour le patient atteint. L’équipe BVGR du LIBM est également impliqué dans un projet menée en Guadeloupe (collaboration avec l’UMR Inserm 1134, l’Unité Transversale de la Drépanocytose et le laboratoire ACTES EA 3596 : S. Antoine-Jonville, Dr M. Billaud, Dr N. Lemonne, Dr M. Romana, Dr M.D. Hardy-Dessources, Dr M. Etienne-Julan, Pr O. Hue) visant à tester l’effet de la condition physique/aptitude aérobie des patients drépanocytaires adultes sur les fonctions micro- et macrovasculaires, les marqueurs du stress oxydatif, les anomalies hémorhéologiques et les microparticules circulantes (projet financé par un PHRC Inter-régional).

Les caractéristiques structurales et énergétiques du tissu musculaire sont, tout comme son réseau microvasculaire, totalement remaniées chez le patient drépanocytaire (Ravelojaona et al. soumis). Nous étudierons également les effets de l’activité physique régulière sur le muscle. Ces aspects sont rapportés dans l’axe « Homéostasie et plasticité musculaire » (L. Messonnier, L. Feasson et T. Rupp) qui fait de la drépanocytose un « axe » transversal fédérateur au sein du laboratoire.

 

3-2 Athérosclérose

Nous avons montré que l’occurrence de lésions et d’inflammation cérébrales, chez des souris ApoE-/- âgées sous régime gras, était divisée par 5 grâce à un entraînement volontaire sur roue d’activité, confirmant l’amélioration du taux de suivis (+50%), la baisse du stress oxydatif et de l’inflammation cérébrale (Chirico et al, 2012, Chirico et al, en révision JACC). Le prolongement cette étude devra caractériser l’effet d’un ré-entraînement sur la récupération cérébrale anatomique et hémodynamique post-AVC après avoir soumis les souris ApoE-/- sous régime gras, à une ischémie cérébrale focale transitoire. Le rôle du stress oxydatif sera aussi étudié avec la méthodologie décrite en 2-2.

 

Références :

Aufradet E, Douillard A, Charrin E, Romdhani A, De Souza G, Bessaad A, Faes C, Bourgeaux V, Chirico EN, Canet-Soulas E, Pialoux V, Martin C. Physical activity limits pulmonary endothelial activation in sickle cell SAD mice. Blood 24;123(17):2745-7, 2014.

Balayssac-Siransy E, Connes P, Tuo N, Danho C, Diaw M, Sanogo I, Hardy-Dessources MD, Samb A, Ballas SK, Bogui P. Mild haemorheological changes induced by a moderate endurance exercise in patients with sickle cell anaemia. Br J Haematol 154(3):398-407, 2011.

Bourgeaux V, Aufradet E, Horand F, De Souza G, Campion Y, Bessaad A, Chevrier AM, Canet-Soulas E, Godfrin Y, Martin C. Efficacy of homologous IHP-loaded red blood cells in sickle cell transgenic mice. Br J Haematol 157(3): 357-369, 2012.

Chirico E., Patsouris D., Geloen A., Rieusset J., Abidi R., Cannet-Soulas E., Pialoux V. The role of exercise on oxidative stress and inflammation in the aging brain. FASEB J 26:708.1, 2012.

Connes P, Lamarre Y, Waltz X, Ballas SK, Lemonne N, Etienne-Julan M, Hue O, Hardy-Dessources MD, Romana M. Haemolysis and abnormal haemorheology in sickle cell anaemia. Br J Haematol 165(4):564-72, 2014

Connes P, Verlhac S, Bernaudin F. Advances in understanding the pathogenesis of cerebrovascular vasculopathy in sickle cell anaemia. Br J Haematol 161(4):484-98, 2013.

Connes P, Alexy T, Detterich J, Romana M, Hardy-Dessources MD, Ballas SK. The role of blood rheology in sickle cell disease. Blood Rev 30: 111-118, 2016.

Diaw M, Pialoux V, Martin C, Samb A, Diop S, Faes C, Mury P, Sall Diop N, Diop SN, Ranque B, Mbaye MN, Key NS, Connes P. Sickle Cell Trait Worsens Oxidative Stress, Abnormal Blood Rheology, and Vascular Dysfunction in Type 2 Diabetes. Diabetes Care 38: 2120-2127, 2015.

Faes C, Balayssac-Siransy E, Connes P, Hivert L, Danho C, Bogui P, Martin C, Pialoux V. Moderate endurance exercise in patients with sickle cell anemia: effects on oxidative stress and endothelial activation, B J Haematol 164(1):124-130, 2014.

Finn AV, Nakano M, Polavarapu R, Karmali V, Saeed O, Zhao X, Yazdani S, Otsuka F, Davis T, Habib A, Narula J, Kolodgie FD, Virmani R. Hemoglobin directs macrophage differentiation and prevents foam cell formation in human atherosclerotic plaques. J Am Coll Cardiol 10;59(2):166-77, 2012.

Kato GJ, Gladwin MT, Steinberg MH. Deconstructing sickle cell disease: reappraisal of the role of hemolysis in the development of clinical subphenotypes. Blood Rev 21(1):37-47, 2007.

Takaya N., C. Yuan, B. Chu et al. Association between carotid plaque characteristics and subsequent ischemic cerebrovascular events: a prospective assessment with MRI—initial results. Stroke 37(3):818–823, 2012.

Waltz X, Romana M, Lalanne-Mistrih ML, Machado RF, Lamarre Y, Tarer V, Hardy-Dessources MD, Tressières B, Divialle-Doumdo L, Petras M, Maillard F, Etienne-Julan M, Connes P. Hematologic and hemorheological determinants of resting and exercise-induced hemoglobin oxygen desaturation in children with sickle cell disease. Haematologica 98(7):1039-44, 2013.